*章離心機及轉子的分類：

一．離心機的分類：

上對離心機的分類方法有三種：按用途分、按轉速分和按結構分。

按用途分類：分為制備型離心機和制備分析離心機。

制備型離心機：僅供分離濃縮，提純試樣的離心機。

制備分析離心機：不但能分離濃縮、提純試樣，而且可以通過光學系統(tǒng)對試樣的沉降過程進行觀察、拍照、測量、數(shù)字輸出、打印自動顯示的離心機。

按轉速分類：分為低速離心機、高速離心機、超速離心機。

低速離心機：轉速在10000rpm以內或相對離心力在15000×g以內。

高速離心機：轉速在10000～30000rpm以內或相對離心力在15000～70000×g以內。

超速離心機：轉速在30000rpm以上或相對離心力在70000×g以上。

按結構分類：

一般在高速和低速離心機根據(jù)結構和功能進行分類，品種繁多，各廠家命名也無統(tǒng)一標準?？煞譃榕_式離心機、多管微量臺式離心機、細胞涂片離心機、血液洗滌臺式離心機、高速冷凍離心機、大容量低速冷凍離心機、低速冷凍離心機、臺式高速冷凍離心機、臺式低速自動平衡離心機等。另外國外還有三聯(lián)式（五聯(lián)式）高速冷凍離心機，專作連續(xù)離心用。

二．轉子的分類應用及特點

轉子是離心機用于分離試樣的核心部件，轉子規(guī)格、品種的多少是衡量離心機生產技術掌握程度的重要標志，轉子一般可分為下列五大類：

固定角轉子（Eixed-Angle-Rotor）：

主要用于分離沉降速度有明顯差異的顆粒樣品。顆粒在扇形溶地移動的距離很短，碰到外壁的顆粒沿著管壁滑到管底，形成沉淀，因此這樣轉子能很快地收集沉淀物。分離過程中，由于管壁的作用，在離心管內將會引起強烈的對流，對具有相同沉降速率的顆粒會產生不良影響。

水平轉子（Siwing-Bucket-Rotor）：

主要用于樣品作密度梯度離心。顆粒移動距離長，溶液中的組分相對于管壁的位置在離心過程中和離心后不發(fā)生改變，因此離心效果好，但因顆粒在離心場中是從旋轉中沿徑向散離出去，而不是按相互平行的路線沉降。顆粒碰到外壁沿著管壁滑到管底，因此也會產生對流。（但比固定角轉子?。┑退贂r啟動或停機時會產生振動，影響分離效果，水平轉子有敞開式和封閉式兩種，一般制備容量大，轉速小于10000RPM，離心力場在16000×g以內的，作成敞開式，主要用于樣品的初分離。制備容量較前者小，轉速大于10000RPM，離心力場在16000×g以上的，為了減少風力的影響，一般作成封閉式，主要用于線粒體、葉綠體、細胞核等的分離和密度梯度離心。

連續(xù)離心轉子（Continuous-Flow-Rotor）：

主要用于懸浮介質中高速分離較小的顆粒物質，如在培養(yǎng)基中分離細胞，在運轉過程中，懸浮樣品以一定速度從轉子體中心流入離心池，由于溶液中的組分輕重不同，在離心力場作用下，重粒子具有較大的慣性離心力、沉降快，當流速增大（降低）到一定值時，重粒子將留在離心池外緣底部，而介質將從出口流出并帶走較輕的粒子，收集組分的方法是把組分沖洗出離心池或者留在轉子體內，這種轉子是利用離心淘析技術隊整細胞或大的亞細胞粒子進行分離，在無菌和低溫條件下，被分離的組分,能保持活性，回收率高等優(yōu)點。如果液流方向與離心力方向相反，即降低了粒子運行速度，相當于增長了運行距離，從而提高了分辨能力。

區(qū)帶轉子（Zonal-Rotor）：

主要用于大容量的密度梯度離心，當實驗所需制備的樣品量多，而水平轉子因受到量的限制時，采用區(qū)帶離心是較好的。主要由帶有四塊葉片的轉子體和密封系統(tǒng)組成，轉子體和四塊葉片將離心池分為四個扇形小室，阻止溶液在離心池中旋轉，葉片上有徑向導管，溶液通過導管從中心流向轉子體外壁，裝樣和取樣時應小心，裝樣一般在2500~3000rpm運轉中進行，首先將梯度液中較輕的部分通過密封管道泵入轉子內，由于慣性力的存在，梯度液在轉子外壁的垂直方向形成均勻的一層，再依次將密度較高的梯度液泵入，隨著密度的增高和梯度液的不斷泵入，密度較低的梯度液被推向中心，直到轉子*裝滿，然后通過密封組件中心輸液管把待分離的樣品（其密度與梯度液中zui輕的密度部分還低）加入，接著把密度更低的溶液注入，用以取代中心附近的樣品，裝完后，移去密封組件，蓋上轉子蓋，在一定轉速離心一定時間后，轉速降至2500~3000rpm，裝上密封組件及輸液管，通過泵入較密的液體到轉子的液體由輕至重依次擠出。

區(qū)帶轉子避免了用離心管所引起的壁效應（Walleffects）和干擾，提高了分辨率。

主要用于樣品在短時間作密度梯度離心。水平轉子分離粒子位移距離長，分辨能力高，分離后組分的區(qū)帶較寬，便于回收，但所需時間長，垂直轉子分離的粒子位移距離等于離心管直徑。轉子轉動前，管內密度梯度溶液的密度是沿重力方向變化，轉動后，溶液的密度逐漸改變?yōu)殡x心力方向（水平方向）變化，離心結束后，溶液的密度變化方向因重力作用又沿鉛垂方向變化，形成鉛垂方向的密度梯度，由于離心管是垂直放置，所以溶液粒子位移的距離等于離心管的直徑。離心時間短，離心后樣品組分的區(qū)帶較寬，但因離心時間短，粒子得不到充分分離，將會失去一些組分，又因區(qū)帶與梯度介質的接觸面大，易于擴散，停機后密度重新定向，易于混合，所以作區(qū)帶離心的效果，垂直轉子不于水平轉子。

離心機轉子的轉速跟轉子的材料和強度有關，一般采用強度好、重量輕的超硬鋁合金（LC4），超速離心機采用鈦合金（TiC4）。一般來說，對同一離心機重量輕、容量小的轉子轉速要高，反之轉速要低。轉子的保養(yǎng)及壽命管理在以后的章節(jié)中介紹。

第二章基本概念

一、關于相對離心力（relative centrifugal force，RCF）

當裝有樣品溶液的離心管、瓶、或袋的轉子置于與馬達相接的轉軸上時，通過馬達提供的動力會使轉子快速旋轉，離心技術正是利用這種高速旋轉產生的離心力達到使樣品溶液中不同性質的顆粒得以相互分開的目的，離心力的大小與旋轉速度以及旋轉半徑成正相關性。由于各種離心機轉子的半徑或者離心管至旋轉軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻中常用“相對離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力，只要RCF值不變，一個樣品可以在不同的離心機上獲得相同的結果。

RCF就是實際離心場轉化為重力加速度的倍數(shù)。

F離=M×ω2×r

M：運動物體的質量

ω：運動物體的角速度

r：運動物體的質量半徑

然而，圓周運動的物體，除受離心力作用外，還受到重力的影響。因此，通常用相對離心力（RCF）來比較不同型號的轉子以及轉子在不同速度旋轉時離心力的大小，公式換算如下：

RCF=F離/F重=Mω2r/Mg=ω2r/g

由于：ω=2πn/60

n：轉速（rpm）

r：旋轉中心至轉頭內離心管某一部位的半徑（cm）

g：為地球重力加速度（980cm/sec2）

所以：RCF=1.118×10-5×n2×r

為了計算轉子的zui大離心力，必須知道離心機使轉子旋轉的zui高速度（nMax）以及轉子的zui大半徑（rMax），即離心管底至主軸間zui大距離。

例如：6Ds4.2轉子所允許的zui大轉速為4200rpm，其zui大離心半徑為25.4cm，因此該轉子的zui大相對離心力為：

RCFMAX=1.118×10-5×25.4×42002=5018×g

如果這一轉子以2000rpm離心時，它的相對離心力為：

RCF=1.118×10-5×25.4×20002=1138×g

由于RCF值隨著轉速的平方而增大，因此轉速的變化會引起RCF更大的變化。

在上式的基礎上，Dole和Cotzias制作了與轉子速度和半徑相對應的離心力的轉換列線圖，見下圖，在用圖1將離心機轉數(shù)換成相對離心力時，先在離心機半徑標尺上取已知的離心機半徑和在轉數(shù)標尺上取已知的離心機轉數(shù)，然后將這兩點簡劃一條直線，在圖中RCF標尺上的交叉點，即為相應的離心力數(shù)值。例已知離心機轉數(shù)為2500rpm，離心機的半徑為7.7cm，將兩點連接起來交于RCF標尺，此交點500×g即是RCF值。

為了使某一特定轉子的離心條件能在另一個類型的轉子上重復并獲得同樣的分離效果，應該考慮到下述相對離心力與離心時間（t）長短間的關系：

t1×RCF1=t2×RCF2

例1：Js5.2轉子的zui大半徑為22.6cm，當該轉子以4000RPM運轉時，可以算出離心管底部的RCF=4050g，離心10分鐘能得到滿意的結果，如果換用Js4.2轉子（Rmax=254mm）仍用4000RPM轉速，它的RCF為4550g，也許500g的差異會影響實驗結果，為了獲得同樣的離心效果，可根據(jù)：

t1=t2×RCF2/RCF1=10×4050/4550=8.9分

因此，Js4.2轉子4000RCF離心8.9分鐘的離心效果與JS5.2（rMAX=226mm）來重復上述條件則可算出所需的運行轉速（n）。

n=1000√3430/1.12×226=3681r/min

也就是說JS5.2的離心速度為3681rpm時，產生的RCF是3430g。

二、離心技術常用的數(shù)學計算

W/w％、w/v％的換算及蔗糖母液的稀釋：

用重量/重量百分數(shù)（w/w％）表示的濃度，在數(shù)值上與用重量/體積百分數(shù)（w/v％）表示的濃度相差極大，例如65％（w/w％）的蔗糖溶液在0℃時相當于86％（w/v％）。而對氯化銫（CsCl），這二者的差別就更大，如53％（w/w％）的CsCl相當于87％（w/v％）。

例：設有密度為1.638g/ml重量百分比濃度為32％（w/w）的氯化銫求其重量/體積百分數(shù)（w/v％）

由公式Cw/v=Cw/ρ可知

Cw/v=32/100×1.638=53％

為方便一般可先配制較濃的母液如66％（w/w）的蔗糖溶液66％（w/w）

蔗糖溶液=2.55M=53％（w/v）折光指數(shù)=1.4558密度=1.3224g/ml在稀釋時根據(jù)下面公式換算

V稀釋后的體積×C稀釋后濃度

V母液=C母液后濃度（w/v）  

例：現(xiàn)有66％（w/v）的蔗糖溶液（p=1.3224），當配100m120％ （w/w） （p=1.081）的蔗糖溶液時需要母液量如下：

V母液=100×1.081×20％/1.3224×66％=24.8ml

因此，取母液24.8ml，加水至100ml即成20％（w/w）的蔗糖溶液。

B.總離心效果ω2T及ω2T積分值的應用

離心過程中往往包括啟動、加速、恒速、減速及運轉終止等階級，在離心機轉子從靜止開始被加速過程中，加在樣品上的相對離心力也逐漸增大，在減速時，情況恰恰相反，一些較大的轉子，其加、減速過程延誤時間較長，對于較粗略的實驗，往往簡單地以恒速階段的離心效果ω2T來表示，如進行較精密的分析實驗，應將這段時間內樣品粒子的移動納入考慮的范圍，除了恒速階段的離心效果外，還要加上加、減速過程的離心效果，因此引入了總離心效果--TCE（total centrifugal effect）并用∫ω2d t來表示，即ω2T的積分值。

∫ω2d t總離心效果用于計算粒子的沉降子數(shù)（S）。

S=1nr2 /rl /∫ω2d t=1nr2 /r 1/ TCE

r1：離心前粒子與軸心距離

r2：離心后粒子與軸心距離

目前Backman公司等一些生產廠家配有自動的ω2T積分器，當設置轉速和運轉時間后。全自動算出ω2T的積分值或設置ω2T值只需設一恒定的速度，離心機會自動確定所需的離心時間。

在設有ω2T自動積分器的情況下，可以利用ω2T圖來計算總的離心效果，并可得到滿意的結果，Backman公司給出了SW50.1等十種轉子的ω2T圖。這些圖中雖只標出了二種密度曲線，對于其它密度可根據(jù)該二種密度曲線來估計所需的時間，也可以計算粒子的沉降系數(shù)。

例：計算離心時間

根據(jù)所希望的粒子的沉降位置從圖中找出相應的Sω2T值

已知條件：實驗用轉子：SW50.1離心用介質：5-20％蔗糖密度：1.8g/ml，溫度：20℃，轉速：40000rpm，粒子沉降系數(shù)：30S=3x10Q。求：粒子在90mm處形成離心帶需離心時間。

解：從SW50.1轉子的Sω2T曲線圖上可以查得總離心效果Sω2T=0.54

據(jù)ω2T=Sω2T/S=0.54/30=1.8

根據(jù)角速度ω和轉速度RPM之間的換算公式ω=0.10472RPM

因此：ω2=（0.10472RPM）2=1.75×10所以：T=ω2T/ω2=1.8×10/1.75×10=10286秒

C.氯化銫（CsCl）沉降平衡曲線的應用

在實際工作中,往往從文獻中查得分離某一物質的運行參數(shù)（溫度、速度、起始密度等），但是，如果查不到這些參數(shù)，那么，究竟在什么條件下進行等密度離心，才能使離心結果滿意呢？

在等密度離心中，常用氯化銫作梯度物質，所以Backman公司的每個轉子說明書中都附有該轉子的CsCl沉降及平衡曲線，利用這些曲線，就可得到zui合適的運行參數(shù)。

三、離心分離的幾種方法

制備型超高速離心機的幾種分離方法：

A.差速離心：逐次增加離心力，每次可沉降樣品溶液中的一些組份。

差速離心是一種zui常用的方法。在這種方法中，離心管在開始時裝滿了均一的樣品溶液。通過在一定速度下一定時間的離心后，就可得到兩個部分：沉淀和上清液。

通常在*次離心時把大部分不需要的大粒子沉降去掉。這時所需的組份大部分仍留在上清液中。然后將收集到得上清液可以進行一步的離心，把所需的粒子沉積下來。離心的時間要選擇得當，使大部分不需要的更小的粒子仍留在上清液中。對于得到的沉淀和上清液可以進行一步的離心，直到達到所需要的分離純度為止。

1、差速離心的特點是操作簡單，但分離純度不高。

B.密度梯度離心法：可以同時使樣品中幾個或全部組份分離，具有很好的分辨率。

1）速率區(qū)帶法（rate zonal）：

根據(jù)樣品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度（S）。大致步驟如下：

在離心管中裝入密度梯度溶液，溶液的密度從離心管頂部至底部逐漸增加（正梯度）。

將所需分離的樣品小心地加至密度梯度溶液的頂部。樣品在梯度溶液表面形成一負梯度。

由于不同大小的粒子在離心力作用下，在梯度中移動的速度不一樣，所以經(jīng)過離心后會形成幾條分開的樣品區(qū)帶。

注意：樣品粒子的密度必須大于梯度液注中任一點的密度。離心過程必須在區(qū)帶到達管子底部前停止。

2）等密度離心法（isopycnic）：

根據(jù)粒子的不同密度來分離。離心過程中，粒子會移至與它本身密度相同的地方形成區(qū)帶。密度樣度的選擇要使梯度的范圍包括所有待分離粒子的密度。樣品可以在密度液粒上面或均勻分布在密度必須梯度中。經(jīng)離心后，樣品粒子達到它們的平衡點。注意：平衡后粒子的分離*由其密度決定，與時間無關，此時再改變離心轉速，只能改變區(qū)帶的相對位置。

2、密度梯度分析法

1）、梯度介質性質與選擇：

A.應具備的性質：

梯度物質的選擇原則是滿足分離方法的基本要求，一個理想的密度材料標準它應是：

l 所形成的溶液密度應包括所需要的密度范圍。

l 具有某些性質，如折射率，據(jù)此可測定它的濃度。

l 所形成的溶液粘度低。

l 不損傷所分離的樣品。

l 離心分離后容易除去。

l 不妨礙離積分的分析。

B.常用介質種類：

表一、常用梯度材料在20℃密度

C.梯度介質應用范圍：

表二、等密度梯度介質的應用

+++很好 ++好 +可以 --不適用

表三、各種大分子在蔗糖梯度液中的大約密度

2）、梯度溶液的準備：

計算

稀釋（本文第三章*部分）

3）、梯度形狀

梯度形狀分：線型、等速型、階梯型、平坦型、陡峭型指數(shù)梯度。（如下圖）

梯度形狀對于分離是否成功非常重要：

zui常用的是線型梯度，適用于分離蛋白質、酶、激素、核糖體亞基和一些植物病毒；等速型適用于分離脂蛋白和一些需上浮分離樣品；不連續(xù)或階梯型梯度zui適用于分離整細胞、亞細胞組分以及純化一些哺乳類動物病毒或昆蟲病毒。等速梯度以及長液柱可增進分離能力，適D.梯度柱制備：

梯度液柱可以用手工或梯度儀制備。

半注法：

為縮減離心時間，或分離樣品較少可用半注法：下半管鋪置梯度介質，中間加樣品，上面鋪Buffer或液體石蠟油。

4）、加樣方法與加樣量：

將樣品加到梯度液柱上，針尖和離心管成45-60°角度，慢慢地將樣品沿管壁流到液面上去，對于DNA一類易斷的脆弱樣品，應該用孔徑較大的移液管代替針頭，以避免剪切力對樣品的切割作用。樣品濃度是梯度柱zui小密度的1/10（W/W）。

5）、轉子的選擇與效應：

6）、分離區(qū)帶的回收及檢測

離心后所形成的區(qū)帶樣品的回收方法基本有四種：

a.穿刺法：

穿刺離心管底部，使梯度溶液滴出，將一具有適合閥門的蓋帽放在離心管頂，可控制滴出速度。

b.虹吸法：

將一毛細管輕輕插入管底，盡量防止梯度抖動，用微量泵逐漸滴取，以一定量滴數(shù)或體積部分收取。

c.加壓法：

通過一針管將高密度的液體泵入到梯度離心管的底部，部分收集換出的溶液。

d.切割法

采用的切割刀切割所需區(qū)帶。

區(qū)帶檢測：

所謂區(qū)帶檢測，實際上是對水平轉子或角轉子和垂直轉子離心管中的分離物質所做的監(jiān)測，通常只是測量在260或280mm時長的吸收值，以決定梯度中的核酸或蛋白的整個分布，這個操作通常稱之為在線（on line）監(jiān)測。